布托
啡诺
文献解读
文献来源影响因子IF=4.3
研究背景
研究背景：
一项报道指出，目前阿片类药物滥用严重，而对阿片类药物和阿片受体之间的分子相互作用了解不足是导致阿片类药物滥用的主要原因之一。只有更深入地了解这些阿片类药物的药理特性，才能开发出特定的适应症并减少副作用。
κ-阿片受体（KOR）在调节疼痛、成瘾等多种生理和病理过程中发挥重要作用，而文献表明布托啡诺通过KOR产生药理作用。
因此，研究布托啡诺和KOR之间的分子相互作用，可能会提高布托啡诺的安全使用，以及发现其潜在的新的临床适应症。
研究目的：
研究布托啡诺和KOR之间的相互作用，以提高其安全使用，发现潜在临床适应症。
研究方法
KOR亲和力测定：用纳曲酮竞争法研究测定布托啡诺与KOR的结合亲和力。
G蛋白活化研究：测定35S标记的三磷酸胍类似物([35S]-GTPγS)与活化的Gαi1亚基结合的积累量，使用GraphPad获得浓度-激活关联曲线，计算异源三聚体G蛋白(Gαi1β1γ2)在激动剂结合的KOR上的初始激活率，从而得到布托啡诺对哺乳动物细胞膜表达的KOR活性的影响。
β-抑制蛋白（由G蛋白偶联受体（GPCRs）激活的独立信号分子）募集研究：用稳定转染人KOR的人胚胎肾-（HEK-）细胞株进行。
布托啡诺对KOR内化的影响：用稳定表达KOR的小鼠神经母细胞瘤Neuro2A细胞(N2A-mKOR-tdT)进行研究。
采用活化态KOR晶体结构对布托啡诺进行对接计算，表征配体的结合位点，以KOR完全激动剂丹酚A作为对照进行比较。
研究结果
布托啡诺与KOR亲和力测定对布托啡诺、地佐辛和丹酚A与KOR的结合情况进行了研究结果表明，布托啡诺与κ-阿片受体的结合强度远大于地佐辛和丹酚A。图1.基于均相时间分辨荧光（HTRF）的结合试验。（ΔF用于同一检测的不同批次的比较，反映了检测的背景信号。ΔFmax是背景的最大比例。X轴是每个被测配体的对数浓度。）布托啡诺对KOR细胞G蛋白的激活及β-抑制蛋白的募集用布托啡诺对重组人KOR进行G蛋白活化试验。该测定法测量响应特定受体配体激活的G蛋白上核苷酸交换的初始速率（图2A）。丹酚A用作阳性对照。结果表明，布托啡诺在KOR上充当G蛋白途径的部分高亲和力激动剂。布托啡诺和丹酚A都以类似的方式诱导KOR的抑制蛋白募集反应.β-抑制蛋白途径中KOR对布托啡诺和丹酚A的浓度-反应曲线如图2B所示。这表明布托啡诺是β-抑制蛋白募集途径中的完全激动剂，类似于丹酚A。图2.KOR激活研究。A.布托啡诺的G蛋白激活途径与丹酚A相比，丹酚A是KOR的完全激动剂，而布托啡诺只对G蛋白途径有部分激动作用；B.布托啡诺和丹酚A均显示对β-抑制蛋白途径具有完全激动作用。布托啡诺对N2A-mKOR-tdT细胞KOR内化的影响正常情况下，大部分KORs位于细胞表面。然而，当布托啡诺的最终浓度在0.1-8μM时，最早在5分钟时就观察到KOR内化。图3显示，在对照条件下没有显著的KOR内化，而在布托啡诺存在的情况下观察到KOR内化。地佐辛能消除布托啡诺引起的KOR内化。图3.共聚焦显微镜下证实布托啡诺诱导N2A-mKOR-tdT细胞KOR内化。N2A-mKOR-tdT细胞不处理(A)或用布托啡诺(0.1μM)处理1h后固定和免疫染色(B)。A.不含布托啡诺的对照组细胞，白色箭头指向KOR过表达的细胞膜。B.存在布托啡诺(0.1μM)的细胞。白色箭头指向细胞内致密的点，表示KOR内化。C.地佐辛预处理(2μM)可消除布托啡诺(0.4μM)诱导的KOR内化，KOR显示白色箭头指向细胞膜。结合腔中的分子相互作用布托啡诺和丹酚A在活性部位与激动剂MP(6B73)共用一个立体结合腔。这两个配体都与KOR正构位点上TM3、TM5和TM7的跨膜结构域(TM)的残基接触。布托啡诺和丹酚A都可在KOR的跨膜区与D形成盐桥（如图4所示）。然而，布托啡诺的四环基团能够比丹酚A的呋喃基团更深入地延伸到正构位点底部的疏水袋中，类似于M的环丙基甲基。布托啡诺的四环基和丹酚A的呋喃基与TM5的Y发生π-π相互作用，使自身稳定在结合腔的底部。图4.活性态KOR中布托啡诺和丹参素A的结合位点（绿色，PDB:6B73）对接预测。。左图中结合位点在方框中放大为右侧插图。布托啡诺(青色)和丹酚A(紫色)与激动剂MP(*色)共用一个结合腔。图中显示了布托啡诺/丹酚A和D之间的盐桥相互作用，氢键在插图中用虚线(*色)表示。研究结论
临床启示
布托啡诺是G蛋白激活途径中的部分KOR激动剂和β-抑制蛋白募集途径中的KOR完全激动剂。结构分析揭示了KOR相互作用和布托啡诺活化的分子机制。
临床启示
KOR在调节阿片类药物成瘾、依赖和疼痛方面发挥着关键作用，尤其是和内脏痛的发生机制密切相关。
布托啡诺可高效激动KOR，是对中枢神经系统无影响的低成瘾性KOR激动剂，可有效治疗内脏疼痛。
供稿｜西南大区推广部李雪娇
审核｜中央市场部赵明月
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